监测食品的质量是非常重要的，因为在生产和储存过程中可能会形成对消费者有害的物质。此外，植物油容易被伪造，这主要是基于混合和添加其他，通常更便宜的等价物或提供虚假的成分和来源数据。这样，从一个非常健康的产品到一个对人体有负面影响的产品的路径非常短。本文对所选冷榨油的荧光光谱和荧光衰减动力学进行了表征，并讨论了所观察到的荧光带的来源。得到的荧光特征是不同油脂的唯一指纹图谱，并显示出由油脂的特定定性和定量组成引起的明显差异。在激发波长350 nm处的发射光谱和在发射波长500 nm处记录的激发光谱中，荧光带形状的差异最明显。所得结果表明，应用稳态和时间分辨荧光测量在鉴定被测植物油中的实用性。

　　植物油被定义为从植物的各个部分获得的液体脂肪。在化学方面，植物油是不饱和脂肪酸酯和饱和脂肪酸酯以及其他伴随化合物的混合物，其中包括生物活性成分，即染料、维生素、酚类化合物和其他脂类(Ba?asińska etal . 2010)。单个成分之间的比例决定了给定植物油的物理化学和生物特性，从而影响其质量并直接影响消费者的健康。特别是，食用油中脂肪酸的组成和含量可以被认为是其质量的重要因素。食用油中脂肪酸的定性和定量可以使用气相色谱法和超高效液相色谱联用质谱法(Lechhab等人，2022;Arena et al. 2022)。然而，植物油的质量问题与脂质稳定性低有关。脂肪酸的生化转化发生在生产和分销的每个阶段，从原料的采购、预处理到加工和储存，因此监测所有这些阶段是很重要的。对脂质质量有决定性影响的主要过程包括:氧化、水解、聚合和与其他组分的相互作用。发生变化的动态取决于内部和外部因素，即温度、获得氧气、光线、水和脂肪酸的组成。产品中发生的变化通常是不希望发生的。不仅油的感官特性会变差，其营养价值也会变差(Zhao et al. 2018)。其中一种油的生产工艺是冷压，这种油是通过机械处理得到的，保留了必需的脂肪酸、磷脂、糖脂、类胡萝卜素、生育酚和维生素。然而，在这一过程之后，还有一些具有不良促氧化作用的物质，如叶绿素和重金属(Skwarek和Dolatowski 2013)。

　　荧光法在分析植物油方面的潜力早在上世纪上半叶就已被研究人员强调。1929- 1930年，由于带木滤的汞灯的普及，紫外线辐射被用来检测初榨橄榄油的掺假(Glantz 1930;西德尼和威洛比1929)。通过对油类荧光的目视观察，发现初榨油(类胡萝卜素和叶绿素含量高)具有特征性的黄色荧光，而精榨油(天然染料-蓝色含量低)具有特征性的黄色荧光。这些研究可以表征不同方法获得的植物油的荧光特征，以及检测初榨橄榄油与其他油在5%水平上的掺假，为利用电磁波辐射进行食品分析的进一步实验提供了前景。目前，光谱学技术因其灵敏度高、速度快、准确度高而受到广泛应用。到目前为止进行的研究涉及许多有助于产品质量的方面，例如原材料的地理来源，生产和储存条件，用更便宜的等价物假冒优质产品(Ahmad et al. 2017)。

　　植物脂肪是许多具有不同化学性质的化合物的混合物，它们之间可能发生许多对荧光有直接影响的过程和相互作用。许多研究人员建议将这两种测量方法结合起来。第一个测量涉及稀释样品(浓度低于1% v/v)在直角几何中进行的荧光。这种方法可以消除与样品的高吸光度相关的不利影响，并减少浓缩系统中发生的分子间相互作用。第二种方法基于对未稀释样品的分析，其优点是可能发射少量或低荧光产率的化合物。未稀释系统的测量是在反射几何中进行的。未稀释样品的光谱具有短波低荧光强度和长波高荧光强度的特点。植物油的光谱显示出许多相似之处，并具有特定类型的独特个体特征(Sikorska etal . 2012)。

　　在植物油中发现的荧光化合物包括:维生素E、叶绿素和酚类化合物、氧化产物(Zandomeneghi等人，2005;Galeano Díaz et al. 2003;Giungato et al. 2002;Dupuy et al. 2005)。根据文献，在λexc=290 nm和λem=325 nm处，可以观察到生育酚的发射。在总荧光光谱中，在250-320 nm的激发波长范围和300-350 nm的发射波长范围内，可以通过强波段观察到维生素E (Zandomeneghi et al. 2005;Sikorska et al. 2004)。在分析短波荧光激发光谱时，可以注意到不同类型油的最大值位置的差异，这可能是生育酚和生育三烯醇的个别形式含量的细微差异的结果(Sikorska 2008)。在同步荧光光谱中，最大约301 nm的波段是由于生育酚的发射(Sikorska et al. 2005;Sikorska et al. 2003)。维生素E是所有植物油中发现的主要荧光成分之一。叶绿素染料的发射波段为λexc=430-450 nm和λem=640-660 nm (Zandomeneghi et al. 2005)。染料主要以叶绿素a和b的形式存在于未加工的油中，它们的分解产物-叶绿素a和叶绿素b和叶绿素b (Cert et al. 2000)。在一些油的同步光谱中，叶绿素产生的最大波长约为666 nm的波段是可见的(Sikorska 2008)。植物油还含有其他荧光成分，即热氧化产物和结构尚未确定的产物。许多化合物的出现取决于许多因素，因此荧光方法可以成功地用于植物油排放的一般特征，根据质量和来源分类，掺假检测，控制加工过程中发生的质量变化(Zandomeneghi等人，2005年;Dupuy等人，2005;Cheikhousman et al. 2005;Poulli et al. 2005;Poulli et al. 2006)。

　　综上所述，植物油是一种极好的健康促进化合物的来源，然而，其优良的品质是先决条件。为了使它们服务于健康，它们必须正确生产、标签、储存和使用。非常需要进一步研究食用个别植物油对人类健康的影响，并改进能够简单快速地分析其质量的方法。监测食品的质量是非常重要的，因为在生产和储存过程中可能会形成对消费者有害的物质。这样，从一个非常健康的产品到一个对人体有负面影响的产品的路径非常短。

　　本研究的目的是表征所选冷榨油的荧光光谱和荧光衰减。在得到的结果的基础上，试图确定稳态和时间分辨荧光法在初步鉴定被试油的有用性。

　　本研究使用了以下植物油:冷榨核桃油，原产地:EU (OW);冷榨玉米油，原产地:EU (K);未精制烤花生油，原产地:EU (A);特级初榨橄榄油，初榨冷榨，原产地:西班牙(O);冷榨葵花籽油，原产地:EU (S)。冷榨植物油保存在4°C的棕色玻璃瓶中。油的使用日期没有超过它们的使用日期(到期日期)。

　　稳态荧光测量

　　用Horiba Jobin Yvon Fluoromax 4荧光光谱仪记录荧光发射光谱和激发光谱。测量是在室温下用石英试管进行的，采用“正面”几何形状。

　　时间分辨荧光测量

　　使用苏格兰爱丁堡仪器公司的FI900cd仪器进行时间分辨荧光测量。荧光激发采用脉冲二极管，可选择脉冲重复频率。使用波长为405 nm和450 nm的二极管产生光。所产生的脉冲的半宽为900ps，而这些二极管的光谱半宽约为。30 nm。激发光通过单色仪，因此激发脉冲的光谱宽度固定在10 nm。同样，在检测通道中，荧光通过单色器，选择发射信号的预定波长，光谱宽度为10 nm。用灰色滤光片控制荧光激发光的强度。同样，在检测通道中，进入检测通道的荧光强度也由灰色滤波器调节。在测量中，将试管放置(在“正面”几何形状中)以消除来自试管表面的反射光激发，并将其引导到检测通道。

　　摘要

　　介绍

　　材料与方法

　　结果

　　讨论

　　结论

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　　冷压植物油在不同激发波长下的发射光谱如图1所示。发射光谱对激发波长的依赖性表明在测试油中存在混合的荧光团。为了验证发射带的来源，我们还记录了发射带最大值处的激发光谱，如图2所示。

　　图1

　　

　　冷榨植物油的荧光发射光谱:核桃油- OW、玉米油- K、烤花生油- A、特级初榨橄榄油- O、葵花籽油- s。激发波长:(A i b) λexc=290 nm， (c) λexc=320 nm， (d) λexc=350 nm， (e) λexc=405 nm

　　图2

　　

　　所研究的冷榨植物油:核桃油- OW，玉米油- K，烤花生油- A，特级初榨橄榄油- O，葵花籽油- S，在发射波长(A λem=320 nm b) λem=380 nm， (c) λem=500 nm， (d) λem=650 nm的归一化激发光谱

　　在图1a(归一化)和图1b(非归一化)所示的研究油的发射光谱中，在290 nm处激发，在300 - 400 nm和350 - 550 nm波长范围内可以看到两个宽的发射带。葵花籽油、橄榄油和花生油的光谱最大值在325 ~ 330 nm，核桃油和玉米油的光谱最大值有轻微的红移。所有被测油的发射光谱形状都是相似的。在发射波长为320 nm处记录的被试油的激发光谱(图2a)在260 nm和300 nm处有两个谱带，最大谱带在260 nm处，而在发射波长为380 nm处(图2b)，被试油的激发光谱在300-360 nm范围内有一个强烈的结构谱带，在260 nm处有一个谱带。对于除葵花籽油外的所有测试油，在380 nm处记录的激发光谱中的较长波长波段比较短波长波段更强。最有可能的是，大约320 nm和380 nm的发射波段是由荧光多酚和/或生育酚的混合物产生的，其含量是每种被测油的特征。除葵花籽油外，所有油的光谱均在350 ~ 550nm范围内有较宽的发射带。在玉米油的归一化发射光谱中可以看到明显的420 nm、445 nm、475 nm、525 nm的振动结构，这是玉米油的特征。在橄榄油的发射光谱中也可以看到轻微的振动结构。

　　当λexc=320 nm激发时，被试油的发射光谱在350-550 nm范围内可以看到宽频带(图1c)。核桃油和花生油在320 nm激发下的发射光谱形状非常相似，最大值分别位于410 nm (A)和420 nm (OW)左右。橄榄油的发射光谱在400 nm和440 nm处有两个峰。在葵花籽油和玉米油(激发波长320 nm)的发射光谱中，最大值位于370 ~ 375 nm，并且在这些油的光谱中可以看到位于约515 nm的肩部。

　　除花生油在350 nm处激发外，其余油的发射光谱在375 ~ 600 nm范围内有较宽的最大值，并具有明显的振动结构，这是每一种油的独特特征。花生油的发射光谱在425 nm处最大，无振动结构。所研究的油在激发波长405 nm处的发射光谱显示出两个波段:一个是在475 nm(核桃油、花生油和葵花籽油)和525 nm处的最大波段，第二个是650-750 nm波长范围内的长波长结构波段。长波长波段最有可能是由于叶绿素及其降解产物的存在，它们在450和650-700 nm左右吸收。在发射波长设置为650 nm的激发光谱中(图2d)， 500-600 nm的长波带(具有给定油的振动结构特征)可以分配给叶绿素染料;然而，在330-475 nm波长中看到的结构带很可能是由化合物的混合物产生的，这些化合物的来源在文献中尚未得到清楚的解释。

　　所研究的油在λem=500 nm处的激发光谱(图2c)显示出具有振动结构的结构带(例如橄榄油在310 nm, 325 nm, 3449 nm和370 nm处;在318 nm, 340 nm, 350 nm, 375 nm和390 nm为葵花籽油);哪种形状是给定油的特征。

　　被测植物油的荧光强度衰减(含噪声)、拟合曲线和激发脉冲形状(仪器响应函数直方图)如图3 (a- 1)所示。拟合参数αi (λexc， λem)和荧光寿命τk τi (λexc， λem)分别见图4和图5。荧光寿命值及其对应的振幅(%)收集于表1。405 nm激发处的荧光衰减分别在465、660和672 nm处记录;而在激发450 nm时，在510、660和672 nm处监测到衰减。对三指数衰减的拟合效果最好。测定的荧光寿命的标准差约为3-5%(数值数据分析误差)。从数值分析得到的结果来看(表1)，可以假设，与它们估计的数值精度相比，单个油的这些参数之间的差异是显著的。这些差异在三指数衰减模型中获得的振幅和荧光消光时间的图形表示中也可见，如图3和图4所示。需要强调的是，被测油脂的荧光信号强度很低，导致单次测量时间较长。由于这个原因，测量单个衰变的时间相对较长，这迫使有必要测量衰变最大值中光子计数非常低的衰变，并且放弃测量较大数量发射波长的荧光衰变。结果表明，利用时间分辨荧光法可以区分被测油脂的种类。振幅和荧光寿命都是荧光强度衰减的有效参数，换句话说，它们的值反映了在给定激发波长和给定检测(发射)波长下产生荧光信号的所有荧光团的光物理特性。所得结果使我们可以假设应用时间分辨荧光光谱法可以区分所有被分析的油样。我们所需要的只是标准化，包括对每种油的大量样品重复这些测试，但这些样品来自不同的制造商。有了这样的测试，就有可能确定每种被测油的荧光衰减动力学的标准参数。

　　图3

　　

　　所测植物油的荧光强度衰减(含噪声)，所测植物油的多指数衰减模型拟合曲线:橄榄油(a-b)、花生油(c-d)、玉米油(e-f)、菜籽油(g-h)、葵花籽油(i-j)、核桃油(k-l)。标题中的激发波长;标题中的发射波长

　　图4

　　

　　所测油脂的多指数荧光衰减振幅值:橄榄油(a-b)、花生油(c-d)、玉米油(e-f)、菜籽油(g-h)、葵花籽油(i-j)、核桃油(k-l)。标题中的激发波长;发射波长用x轴表示

　　图5所示。

　　

　　通过多指数荧光衰减拟合得到的荧光寿命值:橄榄油(a-b)，花生油(c-d)，玉米油(e-f)，菜籽油(g-h)，葵花籽油(i-j)，核桃油(k-l)。标题中的激发波长;发射波长用x轴表示

　　表1拟合参数(荧光寿命组合被试油的荧光衰减的强度及其振幅

　　冷榨植物油中的主要荧光团包括多酚、生育酚和叶绿素染料。由于单个植物油的特征是这些荧光团的特定定性和定量含量，这些荧光团可能相互作用，也可能与其他非荧光成分相互作用，因此植物油的荧光光谱和荧光衰减特性有望成为单个油的唯一指纹，并显示出明显的差异，从而无需事先制备样品即可进行简单的鉴定。

　　冷榨植物油的荧光光谱来源于典型的先前确定和描述的荧光团的存在，以及依赖于植物来源和油类型的独特成分的存在。此外，油组分之间的特定相互作用也可能影响其荧光光谱。

　　冷榨油中存在的一种众所周知的荧光团是生育酚和多酚，它们的荧光带经常重叠。根据Sikorska etal .(2012)的研究，在植物油的发射光谱中观察到的λem=325/330 nm (λexc=290 nm)处的荧光可能属于α-生育酚(Zandomeneghi etal . 2005)。综上所述，生育酚化合物的荧光在300-400 nm范围内(图1 (a和b))，在激发波长290 nm处最大发射波段约为330/335 nm (Zandomeneghi et al. 2005)。被测油脂在λem=320 nm处的激发荧光光谱(图2a)显示，该波段位于298/300 nm左右，其最大值的不同位置(取决于植物油的类型，相差几nm)可分配给维生素a。E. Sikorska etal .(2004)用不同的生育酚成分(αT3， βT3， γT3， δT3)解释了最大值位置的差异。除了观察到的光谱形状和最大位移的差异外，测试的油在单个组分的荧光强度上也表现出差异。在冷榨向日葵油中观察到相对较强的生育酚释放，花生油和橄榄油中等强度，核桃油和玉米油弱。这些差异可能与不同油中个别生育酚组分的不同含量和比例有关。例如，在葵花籽油中，α-生育酚的含量最高(约96%)，而在玉米油中，α-生育酚的含量为20% (Zandomeneghi et al. 2005)。然而，由于被测系统的复杂性，任何定量预测都需要进一步的研究。

　　Dupuy等人(2005)指出，在275-350 nm波长范围内的荧光带也可能由酚类化合物(咖啡酸、对香豆酸)的存在而产生。根据不同的作者，酚类化合物的最大激发波长为264 nm, 270 nm, 280 nm, 310 nm (Lenhardt et al. 2015;Karoui et al. 2007)。由于生育酚和多酚类化合物的发射光谱是重叠的，如果不应用特定的分离技术，就不可能明确地将270-290 nm范围内的发射最大值分配给生育酚或多酚类化合物。

　　位于650- 750nm范围内的长波长波段可以分配给叶绿素染料。在除花生油外的所有测试油的发射光谱中都可以观察到该波段。Zandomeneghi等人(2005)将葵花籽油与花生油进行比较，也得到了类似的结果。作者指出，在花生油的发射光谱中，666 nm处没有荧光信号。根据文献数据，叶绿素a和叶绿素b的荧光波段最大为652nm和675nm (Zandomeneghi et al. 2005)。Sikorska(2008)认为，在405 nm的激发波长下，670 nm的荧光波段可能被分配给叶绿素，Kyriakidis和Skarkalis(2000)和Sayago等人(2007)的研究结果也证实了这一点。植物油中的叶绿素含量主要由油的类型决定，另外观察到的叶绿素含量的变化取决于储存条件以及生产和工艺过程(Kyriakidis和Skarkalis 2000;Sayago et al. 2007)。

　　需要强调的是，由于绝大多数叶绿素在精炼过程中被去除，因此在冷榨未精炼的植物油中可能会出现叶绿素荧光带(650-700 nm)。

　　在图2所示的激发光谱(λem=650 nm)中，在330-630 nm范围内观察到多个波段。在核桃油、葵花籽油和橄榄油的光谱中，有一个最大波长约为415 nm的条带可能是由于叶绿叶绿素(PPP)的存在。这些油还具有高强度的叶绿素带。PPP是叶绿素热降解的结果，经过长时间的储存形成的。Sayago等人(2007)在他们对精制榛子油和橄榄油的研究中观察并描述了PPP荧光。在λem=655处的激发光谱中，分别在328 nm、333 nm、408 nm和414 nm处发现了PPP化合物。PPP的存在也可能表明优质油通过添加精炼替代品而掺假(Sayago et al. 2007)。

　　图1d所示的特级初榨橄榄油的发射光谱与Guimet et al.(2004)获得的非常相似，这可能表明荧光方法在控制/评估油的质量方面的实用性。冷榨油发射光谱中的短波长波段分别属于生育酚/多酚和叶绿素染料。然而，在核桃、花生、玉米、向日葵和橄榄油的发射光谱中，在330-600 nm的中间范围内观察到一个结构化的波段(图1c)。单个谱带的最大值位置对特定类型的油是不同和特定的(葵花籽油为370 nm，玉米油为380 nm，花生油、核桃油和橄榄油分别为409 nm、418 nm和435 nm)。位于300-600 nm中间范围内的荧光带起源尚不清楚。一些研究人员认为，这条条带可能源于脂肪酸的存在，而另一些人则认为这条条带是氧化产物或其他未识别的化合物。

　　Poulli et al.(2005)在329-545 nm区域的荧光强度可能与油酸的存在有关，其荧光带位于405 nm。花生油、橄榄油和菜籽油都是油酸含量高的油(Poulli et al. 2005)，因此，在花生、核桃和橄榄油的发射光谱中观察到的409 nm处的强烈荧光(图1c)是油酸引起的，这似乎是合理的。然而，值得注意的是，根据文献，核桃油的油酸含量是花生油和橄榄油的三分之一(Poulli et al. 2005)。

　　一些脂肪酸的吸收和荧光性质也已被其他研究人员指出。根据Smyk等人(2009)的研究，各种油类(油菜、葡萄籽、向日葵、月见草、红加仑子和黑加仑子、大豆、橄榄油)中四烯的荧光光谱非常相似，荧光带的最大值为415 nm。在除葵花籽油外的所有被测油的发射光谱(λexc=320 nm)中。(图1c)，在409-418 nm处观察到相似的波段。然而，很难假设这些条带仅由一个四烯异构体产生。作者还强调，在脂肪酸中，只有共轭双键系统的不饱和酸表现出荧光。目前，关于植物油中存在五烯和四烯的文献资料不足(Smyk etal . 2009)。Mateo et al.(1996)报道的数据表明，具有4个反式双键和1个顺式双键的戊烯(c-COPA)在激发光谱中存在313 nm、331 nm和348 nm处的最大能带。在λem=500 nm处记录的激发光谱中(图2c)，橄榄油在约310 nm、325 nm、350 nm处，葵花籽油在315 nm、340 nm、350 nm处观察到相似的波段，核桃油和花生油在350 nm处观察到单一的波段。

　　在测试油的发射光谱中，在450- 550nm范围内发现了一个小波段(图1c)。根据文献数据，在450 ~ 550 nm范围内(λexc=320 nm)，最大波长为475 nm的发射波段可能属于c-COPA。位于300-600 nm范围(λexc=320 nm和350 nm)的发射带如图1c所示，Zandomeneghi et al.(2005)也观测到了这一波段。结果表明，在橄榄油的发射光谱中存在最大波长为385 nm、439 nm和470 nm的波段。本研究得到的橄榄油的结果如图1c所示，与文献中的结果非常相似。Zandomeneghi等人(2005)也指出，与花生油相比，葵花籽油的强度更低。

　　根据Sayago et al.(2007)，位于420-460 nm和460-490 nm发射范围的波段与共轭二烯(K232)、三烯(K270)和水解产物的存在相关，尽管这些二烯和三烯不是荧光的。Kyriakidis和Skarkalis(2000)指出，在445 nm (λexc=365 nm)处观察到的波段与脂肪酸氧化产物(共轭二烯- K232和三烯- K270)的水平相关。同样，Guimet et al.(2005)在对橄榄油的研究中指出，在λem=445 nm和λem=475 nm附近存在两个波段，这表明它们与加热形成的产物有关。共轭氢过氧化物(一次氧化产物)在232 nm (K232)处具有较高的紫外(UV)吸光度，其存在与油脂的过氧化物(PV)值有关。由于氢过氧化物的稳定性不高，它们会迅速分解成醛类、酮类和低分子量酸(二次氧化产物)。这些化合物在270 nm处具有高吸光度(K270) (Guimet et al. 2005)。

　　在玉米油、葵花籽油和橄榄油的发射光谱中观察到的515/520 nm波长的荧光(图1d)可能来自维生素B2或FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)和FMN(黄素单核苷酸)。这些假设是基于Zandomeneghi等人(2005)的研究结果，他们观察到在油样品中加入越来越浓的核黄素后，在524 nm处荧光强度成正比增加。植物油中维生素B2的低强度波段可能是由于存在其他物质，如类胡萝卜素，其特征是高消光系数(Zandomeneghi等人，2005年)。在515/520 nm附近存在荧光的另一种解释是与叶绿素猝灭有关。Kyriakidis和Skarkalis(2000)强调，被测样品中叶绿素含量的减少导致525 nm处荧光强度的增加。

　　在本研究中获得的结果表明，应用稳态和时间分辨荧光测量在鉴定测试的未精制，冷榨植物油中的效用。在λexc=350 nm处的发射光谱和λem=500 nm处的激发光谱中，荧光带形状的差异最为明显。荧光带的相似位置表明，荧光来自天然存在于油中的类似的荧光团。然而，化合物的比例和数量之间的差异导致特定类型油的独特荧光图像。此外，时间分辨荧光光谱分析结果显示，所获得的参数:寿命及其对不同波长监测的荧光衰减的贡献存在差异，从而可以区分被测植物油。

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