甲型流感病毒(IAV)引起猪呼吸道疾病，是公共卫生的一个主要问题。猪的疫苗接种是减轻猪群中疾病影响的最成功措施。基于流感的病毒体是一种有效的免疫调节载体，它复制天然抗原呈递途径，由于其纯度和生物相容性而具有耐受性。

　　本研究旨在开发一种含有猪流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亚型血凝素和神经氨酸酶蛋白的多价病毒体流感疫苗，并研究其作为猪流感疫苗的小鼠有效性。小鼠分别用两剂疫苗(1天和15天)进行肌肉注射和鼻内注射。在第二次接种疫苗21天和8个月后，对小鼠实施安乐死。研究了经鼻或肌注射多价流感病毒体疫苗的小鼠体液和细胞免疫反应。

　　只有肌肉注射疫苗可诱导高血凝抑制(HI)滴度。在加强免疫21天后，80%的小鼠(肌肉注射组)实现了血清转化和血清保护(HI抗体滴度上升> 4倍，滴度≥1:40)。在接种疫苗8个月后检测到针对IAV的病毒中和抗体滴度，表明长效免疫。总的来说，用病毒体免疫的小鼠表现出来自脾脏的B细胞、效应t细胞和记忆t细胞对H1N1、H1N2和H3N2抗原的反应能力更强。

　　所有研究结果表明，接种多价病毒体流感疫苗的小鼠对iav有有效的免疫应答。

　　2009年H1N1流感大流行病毒(H1N1pdm09)有力地说明了甲型流感病毒(iav)在全球范围内引起人群发病和死亡的潜力，以及猪在人畜共患病毒进化中的重要性[1]。猪容易感染禽流感和人流感病毒，因此可以通过流感基因片段的重组成为新病毒出现的“混合容器”[2]。IAV在世界各地的猪中流行，在不同的地理区域流行着H1N1、H1N2和H3N2亚型的多种遗传和抗原性不同的病毒谱系[3,4]。临床上，流感病毒感染引起急性呼吸道疾病，表现为发热、嗜睡、咳嗽、厌食和流鼻水。IAV破坏呼吸道的正常防御系统，可能导致继发性细菌感染[5]。

　　减轻和控制猪群中与IAV相关的发病率和死亡率的最有效措施是接种疫苗。猪流感疫苗接种对人类健康同样至关重要，因为它减少了猪到人以及人到猪的IAV传播，降低了大流行风险和出现新毒株的可能性[2,6]。在巴西，目前获得许可的猪用IAV商业化疫苗是基于整个灭活H1N1pdm09病毒(WIV)。这种疫苗的保护作用主要是通过诱导针对血凝素(HA)的抗体，以及在较小程度上针对神经氨酸酶(NA)病毒糖蛋白的抗体来实现的[7,8]。然而，对于一种高效的疫苗，疫苗抗原必须与猪群中流行的iav具有密切的抗原匹配[9,10]。

　　通过遗传和抗原鉴定对猪体内IAV的监测对候选疫苗的选择至关重要。最近，在巴西猪群中发现了IAV的巨大遗传多样性，这可能对交叉保护疫苗的设计有影响[11]。从这个意义上说，该国现有的猪用IAV疫苗可能对目前流行的遗传上不同的猪IAV提供有限或缺乏保护。此外，iav具有通过抗原漂移和抗原转移机制逃避宿主免疫反应的能力，这需要定期更新组成疫苗的病毒以匹配流行病毒[12]。

　　在过去几年中进行了几项研究，旨在开发广泛保护的疫苗，诱导体液[13,14]和细胞免疫反应[3,7,15,16,17]。一般来说，这些疫苗针对HA上抗原保守的表位[18,19,20]，由病毒样颗粒(VLP)表达[21]。然而，所提出的解决方案都没有产生一种实用的疫苗，可以诱导广泛的异亚型保护或实现所需的灭菌免疫。通过混合亚型特异性免疫原的多价疫苗或使用在循环IAV亚型中保守的良好免疫原，可以实现对IAV的广泛保护[8]。多价流感疫苗可以减少流感疫苗的固有局限性，因为它们被设计用于防止在猪群中传播的不同流感病毒[17,22]。此外，为了通过免疫实现有效免疫，病毒中和抗体的靶点需要与循环中的iav抗原匹配，而猪体内的iav由不同谱系的H1N1、H1N2和H3N2亚型分离物组成[23,24]。

　　病毒体是由纯化的包膜成分在体外产生的VLPs;然而，它们缺乏原生病毒的遗传物质和内部蛋白质。流感病毒体结合了调控良好的组合物的技术优势和VLPs的免疫学优势[25]。在病毒体的磷脂双分子层内结合的是功能性IAV包膜糖蛋白，HA和NA。这些病毒蛋白不仅为病毒体配方提供了结构稳定性和均匀性，而且还对病毒体的免疫特性做出了重大贡献，这使它们与其他脂质体系统区别开来[26]。含有HA蛋白的病毒体的全功能融合活性允许受体介导的抗原摄取和自然的细胞内加工，从而触发体液和细胞免疫反应[27]。本研究采用可透析短链磷脂(1,2- dicaproyl - cn - glycero -3- phosphocholine, DCPC)作为增溶剂，构建了以H1N1pdm、H1N2和H3N2病毒为基础的三价猪流感病毒体疫苗;它维持包膜蛋白的功能，并在病毒体产生过程中被透析完全去除[28]。此外，通过测量小鼠对IAV疫苗株的细胞免疫反应和血清抗体反应，证明了病毒体的有效性。

　　选取3株猪源iav制备流感疫苗:A/swine/Brazil/025?15/2015 1 A.3.3.2 (H1N1pdm;HA=MH559931, NA=MH559933;BRMSA 1710)， A/swine/Brazil/223-15-1/2015 1B.2.4 (H1N2;HA=MH560035, NA=MH560037;BRMSA 1698)和A/swine/Brazil/028-15-8/2015 (H3N2;HA=MH559963, NA=MH559965;BRMSA 1697)。将H1N1和H1N2病毒样本在SPF (Specific Pathogen-Free)鸡胚中繁殖，H3N2病毒接种于Madin-Darby犬肾(MDCK;BCRJ)细胞，据Zhang和Gauger[29]。为了确认IAV的存在，我们用血凝试验[30]和RT-qPCR[31]检测了从卵子中采集的细胞上清和绒毛膜尿囊液。

　　每种病毒约1l分别通过切向超滤进行浓缩，使用流量泵连接到含有由聚醚砜(PES)组成的透析膜的盒，截止值为100 kDa (Vivaflow 200 System, Sartorius，德国)。然后，每种病毒浓缩物各50 mL，在4°C下，10万x g超离心4小时(Optima LE 80 K, Beckman Coulter, USA)。排出上清液，在TNE缓冲液(10 mM Tris, 100 mM NaCl和1 mM EDTA, pH 7.4)中将每种病毒的微球稀释至终体积为5 mL。浓缩后的病毒用血凝试验滴定[30]，用SDS-PAGE (NuPAGE?Bis-Tris, Thermo Fisher, USA)测定血凝素含量，采用丙烯酰胺凝胶板(4-12%)和银染色，按照制造商推荐。利用从白蛋白标准校准曲线得到的方程，根据条带强度(用ImageJ软件获得)计算HA浓度。

　　多价病毒体是根据de Jonge, Leenhouts[32]进行修饰后制备的。简单地说，将相同体积的每种病毒(1:1:1)混合并稀释在200 mM的1,2-二丙基- cn -甘油-3-磷酸胆碱溶液中(DCPC, Avanti Polar Lipids, USA)。匀浆后，将混合后的病毒在TNE缓冲液中进一步稀释1:2 (v/v)，并在冰浴中保存30分钟，以确保病毒包膜的溶解。然后，在4°C下，将混合物以100,000 x g超离心30分钟，以去除病毒核衣壳。将上清液在纤维素透析管(截止时间为10 kDa, SpectraPor, USA)中与TNE缓冲液在4°C下广泛透析48小时，以去除表面活性剂(DCPC)，从而导致病毒体囊泡自组装。随后，确定透析后的病毒体制剂的物理化学特性，通过动态激光散射和激光多普勒电泳(Zetasizer, Malvern)测量颗粒大小和zeta电位。采用SDS-PAGE法测定H1N1、H1N2和H3N2的HA抗原含量。

　　采用JEOL JEM-1011显微镜(JEOL JEM-1011, JEOL, Japan)透射电子显微镜(TEM)观察病毒体的形态和超微结构。样品用纯净水或在超纯水中稀释50%。分析前，将3μL的病毒体悬液沉积在覆盖有Formvar?的铜网格中。铜网格固定，完全干燥后，与1%四氧化锇蒸气对比。因此，将40μL四氧化锇放置在含有铜网格的培养皿底部40分钟。使用连接到Digital Micrograph 3.6.5?计算机软件(Gatan, USA)的UltraScan?相机对病毒体进行数字化。为了消除对1%四氧化锇对比中哪些是病毒体以及哪些是伪影的任何疑问，在分析期间创建了仅使用超纯水和四氧化锇的阴性对照[33]。

　　为评价病毒体的感染性，将其接种于鸡胚中，37℃孵育4 d。将病毒体接种于MDCK细胞，监测7 d。

　　为了进行体外细胞毒性试验，将永生化巨噬细胞系(RAW 264.7细胞，BCRJ-0212)培养在完全的Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium (DMEM, Invitrogen)中，该培养基含有4 mM谷氨酰胺(Gibco)， 4500 mg/L葡萄糖，1 mM丙酮酸钠(Sigma-Aldrich)和1500 mg/L碳酸氢钠(Sigma-Aldrich)， 10%的胎牛血清(FBS) (Sigma-Aldrich)。RAW 264.7细胞在37°C和5% CO2条件下培养和保存。细胞单层形成后，用刮削法剥离贴壁细胞。最初，将RAW 264.7细胞(2 × 105个细胞/孔)接种于96孔板中，培养24小时以粘附，然后用不同稀释的病毒体制剂(1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:128和1:256,v/v)处理24、48和72小时。对细胞培养的不同传代重复此过程，直到达到所需的样本量(n=8)。对照细胞接受相同体积的简单脂质体(由磷脂制备- Lipoid?S100, Lipoid)。采用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑，Sigma-Aldrich)法测定细胞活力。在每个孵育时间结束时，去除培养基，用DPBS (Sigma-Aldrich)洗涤细胞两次，用5 mg/mL MTT溶液在37℃下孵育3小时。孵育后，将沉淀的甲醛晶体溶解在200μL二甲基亚砜(DMSO, Sigma-Aldrich)中。使用Multiskan?FC微孔板光度计(Thermo Fisher Scientific)在540 nm处测量光密度(OD)。未经处理的细胞(阴性对照)记录的吸光度值代表细胞活力的100%，并作为计算每种样品浓度下细胞活力百分比的参考。使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和碘化丙啶(PI)染色试剂盒(APO-DIRECT?，BD Biosciences)进行互补细胞毒性分析。如上所述，用病毒体稀释液(1:32和1:64)对RAW 264.7细胞进行镀膜和处理。在暴露于病毒体后24、48和72小时，根据制造商的指南进行检测[33]。染色方案包括用TdT-FITC酶孵育细胞和碘化丙啶染色。暴露24和48小时后，使用流式细胞仪(Accuri C6 Plus, Becton-Dickinson, USA)分析细胞，并测定每组完整细胞膜的百分比。根据试剂盒说明书定义的荧光读数计算活细胞的百分比。

　　本研究的方案和动物使用符合Embrapa猪和家禽动物使用伦理委员会(方案号001/2016)。在SPF条件下饲养C57BL/6雌性小鼠(6 - 8周龄)，分为3组:未接种对照组(NV, n=20)、鼻内接种组(5μL/鼻孔或10μL/只，IN, n=20)、肌内接种组(100μL/只，IM, n=20)。另一组，未接种脂质体对照组(n=20)，作为病毒体的对照组。与NV组的动物相比，G4组在进行的分析中没有显示任何差异(数据未显示)。在配方中加入黏附佐剂(羧甲基纤维素- CMC) (0.125%， m/v)用于鼻内给药，乳液- d?(MVP佐剂，美国)用于肌肉内给药(20%，v/v)[34]。实验方案包括间隔2周(第1天和第15天)接种两剂疫苗。在第二次接种疫苗后第21天(第36天)和第8个月(第255天)，三组中每组10只动物通过腹腔注射戊巴比妥钠(80μg/g体重)安乐死。

　　采集血液时，小鼠腹腔注射氯胺酮-羟嗪(氯胺酮60μg/g体重，羟嗪10μg/g体重)麻醉。分别于接种前第0天、接种后第3天和第17天(接种后2天)眼眶后出血抽血。为了评估疫苗可能的毒性，对血清样本中的生化标记物进行了量化，评估了肝脏(AST和ALT)和肾脏(尿素和肌酐)功能。根据制造商的说明(Labtest，巴西)，使用比色试剂盒进行这些测定。

　　组织病理学分析，尸检时收集肝、肾和肺组织样本，用4%多聚甲醛缓冲固定，用分级乙醇脱水，石蜡包埋，在4 μm处切片。用苏木精-伊红(H&E)染色。此外，为了评估病毒体的体内细胞毒性，根据制造商的说明，使用原位细胞死亡检测试剂盒(罗氏，德国)进行细胞凋亡染色。细胞核用3,3-二氨基联苯胺反染(Sigma-Aldrich, USA)。TUNEL法通过tdt介导的dUTP-X缺口末端标记的原位反应来鉴定和定量凋亡细胞核。在400倍放大镜下对tunel阳性核进行定量。计算25个不同视场(对应总面积为0.08 mm2)的TUNEL表达程度。结果以细胞/mm2表示。

　　小鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF)在尸检(第36天和第255天)时在生物安全柜中通过气管切开术获得。用0.2 mL无菌生理盐水(0.9% NaCl)经气管插管冲洗肺4次收集BALF。收集BALF后，加入蛋白酶抑制剂混合物至终浓度为1x，加入苯基甲基磺酰氟(PMSF)至终浓度为1mm。一部分BALF样品在-80°C保存用于ELISA检测。使用Invitrogen试剂盒(美国赛默飞世尔公司)，按照制造商的建议，采用ELISA定量BALF上清液中的总IgA免疫球蛋白。另一部分BALF样品用于细胞定量。采用Neubauer室台盼蓝排除法进行细胞定量。为了鉴别细胞学分析，用悬浮液的等分物制备干燥细胞涂片，并用may - grind - giemsa染色进行染色。用光学显微镜对载玻片进行分析。每个高倍视场至少计数500个白细胞，通过将每种给定细胞类型的百分比乘以总细胞计数来计算绝对差异细胞计数。

　　小鼠麻醉后，于第0、36和255天通过眶后神经丛采血。然后，通过血凝抑制(HI)试验评估血清中是否存在iav特异性抗体[35]。在病毒体疫苗组合物中使用的相同的IAV株被用作HI试验的抗原。结果报告为几何平均抗体滴度。

　　尸检(第36天和第255天)时，在RPMI 1640培养基(Gibco)中无菌收集每只小鼠的完整脾脏。每个脾脏被机械分离，并通过尼龙过滤器(70 μm)过滤。然后，用Pharm Lyse?缓冲液(BD Biosciences)裂解红细胞。加入含2% FBS的RPMI 1640培养基停止裂解反应，清洗细胞2次。细胞重悬于完整的RPMI 1640培养基中，添加10% FBS (Gibco，巴西)、1 mM GlutaMAX (Gibco，巴西)、25 mM HEPES (Sigma-Aldrich，美国)、1 mM丙酮酸钠(Sigma-Aldrich，美国)、50 M 2-巯基乙醇(Gibco，美国)和100 U/mL青霉素-链霉素(Sigma-Aldrich，美国)。最后用0.4%台盼蓝计数细胞数，测定活细胞浓度。一般来说，小鼠脾脏产生约8-10 × 107个活脾细胞。细胞重悬于95% FBS + 5% DMSO (Sigma-Aldrich)中，终浓度为2 × 106个细胞/mL冷冻保存。

　　根据先前的报道[36]，将活的脾细胞解冻后，以5 × 106个细胞/mL的浓度悬浮在DPBS中，并使用CellTrace?CFSE细胞增殖试剂盒(Invitrogen)用2.5μM羧基荧光素琥珀酰氨基酯(CFSE)进行标记。CFSE标记后，脾细胞重悬于完整的RPMI 1640培养基中，镀于24孔板(5 × 106个细胞/孔)。随后，在体外黑暗条件下，在37℃，5% CO2下，添加8000 TCID50/mL的三种疫苗病毒(H1N1, H1N2和H3N2)刺激细胞96 h。阴性对照只在细胞(未受病毒刺激的细胞)中加入培养基，阳性对照分别用5μg/mL的Canavalia ensiformis (Sigma-Aldrich)的Concanavalin A刺激细胞。在体外用H1N1、H1N2和H3N2病毒刺激细胞后，在增强免疫21天后，测量脾脏淋巴细胞增殖情况，作为T和b细胞应答的指标。

　　CFSE与单克隆抗体(mab)联合使用，可以同时获得细胞亚群的细胞增殖和激活状态。通过CFSE荧光缺失检测增殖[36]。流式细胞术分析鉴定和定量淋巴细胞亚群(CD3e、CD4、CD8α、CD19、CD45R/B220和sIgM单克隆抗体)，测量细胞活化水平和成熟静息标志物表达水平(CD23、CD25和CD69单克隆抗体)，以及细胞记忆标志物表达水平(CD62L和CD44单克隆抗体)(Becton Dickinson;表1).计算细胞密度并转移到流式细胞仪管中(约1 × 106/孔)。用阻断液(10% v/v正常小鼠血清)处理细胞，阻断第二抗体上未占用的结合位点，然后在室温下用特异性单克隆抗体(表1)、7-氨基放射线霉素D (7-AAD)和同型对照(BD Biosciences)在暗室中标记细胞30分钟。使用的抗体浓度符合制造商的说明。

　　表1荧光染料标记mo面板noclonal抗体

　　在样品分析之前，按照制造商的说明，使用流式细胞仪设置和跟踪珠(CS&T珠，BD)检查流式细胞仪设置。补偿珠与每个抗体的单染色建立补偿设置。补偿矩阵同样适用于所有样本。侧散射(SSC)阈值水平设置为8,000个单位以消除碎片。根据样品的荧光减一(FMO)测试设置考虑指示阳性和阴性染色细胞的门，这些门一致地应用于每个样品，允许对SSC可变性进行微小调整。流式细胞术采用7-氨基放线菌素D (7-AAD)染色区分死细胞和活细胞。在初步建立仪器技术参数的过程中，采用同型对照对荧光非特异性染色进行评价。用含有0.01% w/v叠氮化钠(Sigma-Aldrich)、2% v/v牛血清白蛋白(Gibco)和2% w/v牛血清白蛋白(BSA, Sigma-Aldrich)的PBS配制流式细胞术缓冲液。

　　在流式细胞仪(Accuri C6 Plus和FACSCanto, Becton-Dickinson，美国)中，每管共获得100,000个事件，并使用FlowJo软件(Becton-Dickinson，美国)进行分析。淋巴细胞门设置在光散射特性上(前散射vs侧散射)。流式细胞术检测CFSE的增殖(通过染料分布到子细胞的荧光强度的连续降低来反映)。结果以染色细胞的百分比表示。

　　采用统计分析系统(SAS - Cary, North Carolina, USA)的MIXED程序，通过方差分析分析接种组(鼻内注射- IN和肌内注射- IM途径)和未接种组(NV)在生化数据、免疫球蛋白、凋亡率和BALF细胞计数方面的差异。此外，使用双侧Student 's t检验评估这些组在体外细胞增殖试验中的差异。采用方差分析(F检验)评价给药途径和年龄对体外细胞增殖试验的影响，当检测到病毒体的显著影响(P≤0.05)时采用Tukey检验。对于HI的分析，使用Fisher精确检验的描述性概率水平;根据费雪精确检验，直线上不同字母后面的百分比差别很大。P值≤0.05认为有统计学意义[37]。

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　　经超离心和超滤纯化后，将扩增的流感病毒浓缩约500倍。表2给出了制备多价病毒体前iav的血凝滴度和HA含量。进行了配方前研究，我们发现使用等量的每种病毒株(1:1:1)可以使配方在冷藏下更稳定。

　　表2血凝滴度与血凝素浓度用于生产病毒体疫苗制剂的iav的含量

　　纯化后的病毒体装在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。SDS-PAGE分析(以白蛋白为标准的半定量方法;根据每个IAV糖蛋白的预期分子量，图1)显示纯化的病毒体主要含有HA。病毒体总HA含量接近160μg/mL。此外，考虑到每种病毒的HA含量，由于每种病毒的HA含量不同，我们估计配方中呈现的HA总量分别对应于H1N1、H1N2和H3N2的6、21和73%。

　　图1

　　

　　SDS-PAGE凝胶和牛血清白蛋白标准曲线(约66.5 kDa)。用于定量病毒株和多价病毒体的血凝素。在SDS-PAGE凝胶上可见:HA由两种形式组成，未裂解的HA (HA0≈75-65 kDa)和裂解的HA (HA1≈55 kDa和HA2≈27 kDa);NA(≈45-50 kDa)。利用ImageJ软件获取波段强度

　　病毒体配方的粒径和zeta电位分别约为110 nm (PDI=0.19)和- 6.2。TEM图像显示圆形和椭球结构，如图2所示。病毒体平均直径为100 nm，呈单层膜，有时在其附近有气泡。

　　图2

　　

　　H1N1、H1N2和H3N2流感毒株产生的多价病毒体的透射电镜图像。在80千伏下拍摄的图像

　　首先，为了确保病毒体由非感染性纳米颗粒组成，在胚胎鸡蛋和MDCK细胞中评估了病毒体的感染性。在接种病毒体的鸡胚蛋中未观察到病毒复制，与对照细胞相比，对细胞系没有明显的细胞病变作用。

　　将RAW 264.7细胞分别暴露于1:2 ~ 1:256 (v/v)不同浓度的病毒体中24、48、72 h，评估细胞活力(表3)。孵育24、48 h后，所有病毒体浓度的细胞活力均在80%以上，表明病毒体是安全的。然而，将细胞暴露在1:2至1:8的病毒体稀释剂中72小时后，细胞存活率在75 - 80%之间，表明长期暴露具有轻微的细胞毒性。此外，与MTT试验中的阴性对照相比，在这段孵育时间内，暴露于评估的其他病毒体稀释剂对细胞活力没有影响(> 80%)。总的来说，在所有暴露时间内，病毒体制剂在1:16至1:256稀释时均具有良好的耐受性。在细胞凋亡方面，在同一时间段(24、48和72小时)，两种病毒体稀释度(1:32和1:64)下，流式细胞术测定的细胞毒性率(凋亡细胞)范围为1%至2%[38]。

　　表3巨噬细胞(RAW 264.7细胞系)暴露于不同稀释度的病毒体制剂后的细胞活力

　　无论采用何种病毒体疫苗给药途径，未接种疫苗的小鼠和接种疫苗的小鼠均未发现明显的损伤迹象或差异(表S1，附加文件1)。肝脏(AST和ALT)和肾脏(尿素和肌酐)值均在正常范围内[39]。此外，小鼠未出现与使用病毒体免疫相关的不良反应。

　　在组织病理学分析方面，所评估的不同组织(肾、肺和肝)未见相关的显微镜变化。此外，TUNEL实验显示，使用病毒体免疫的动物肾脏和肝脏的细胞凋亡率在36天没有差异，这与对照组相似(图S1，附加文件2)。

　　平均而言，BALF恢复量为82%。鼻内接种组、肌内接种组和未接种组小鼠36天BALF总细胞计数平均值分别为8.8±1.2 × 105细胞/mL、7.65±0.9 × 105细胞/mL和5.7±0.7 × 105细胞/mL。在所有组中，BALF的细胞组成主要由肺泡巨噬细胞(> 53%)和少量淋巴细胞(< 43%)和中性粒细胞(< 1%)组成。与未免疫的小鼠相比，两组免疫小鼠(鼻内和肌肉内)均显示淋巴细胞数量增加(P≤0.0001)(表4)。鼻内免疫小鼠的总细胞数量也有更大的增加。

　　表4两剂病毒体后21天小鼠BALF白细胞计数的差异

　　在肌肉注射和鼻内注射加强免疫后第21天(第36天)和第240天(第255天)获得的血清样本中检测三种IAV亚型(H1N1、H1N2和H3N2)的血凝抑制(HI)效价。肌内注射病毒体免疫小鼠血清HI滴度明显高于鼻内注射(P≤0.0001;图3)在随访评估中(第36天)，肌内注射组所有小鼠对H3N2均有疫苗诱导的HI抗体滴度(比例为1:40)。少量肌内免疫小鼠对H1N1和H1N2抗体效价(小于1:40)的反应较弱。然而，肌肉注射疫苗在小鼠中具有免疫原性，并引发了对H1N1, H1N2和H3N2的显著HI抗体反应。加强免疫21 d后，血清转肌免疫为90% H1N1, 80% H1N2, 100% H3N2。

　　图3

　　

　　血凝抑制(HI)试验。(NV)未接种疫苗，(IM)肌肉注射疫苗，(IN)鼻内接种疫苗。疫苗接种后第21天和第240天小鼠血清样品中H1N1、H1N2和H3N2亚型的抗体滴度。数据显示为每组每只小鼠，黑线表示几何平均滴度±标准差

　　另一方面，鼻内接种的小鼠在加强免疫21天后(第36天)没有产生可检测到的HI抗体滴度。在第二次免疫8个月后，只有一只经鼻内接种疫苗的小鼠出现了H1N1(滴度1:40)、H1N2(滴度1:40)和H3N2(滴度1:40)病毒的hi抗体，如图3所示。与鼻内免疫(10% H1N1, 10% H1N2, 10% H3N2)相比，肌内免疫在加强免疫8个月后的血清转化率(90% H1N1, 40% H1N2, 100% H3N2)更高。

　　测定小鼠半胱氨酸中总免疫球蛋白IgA的含量。ELISA检测总抗体结果显示，无论给药途径如何，接种小鼠免疫后第21天IgA浓度均高于未接种小鼠(6.85±0.98 mg/dL) (P≤0.0001)。经鼻注射该病毒体的小鼠IgA浓度(57.84±3.61 mg/dL)高于肌注射的小鼠(36.81±5.39 mg/dL, P≤0.0001;图4)。

　　图4

　　

　　ELISA法测定小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中总IgA抗体。数据显示为每组每只小鼠的数据，黑线表示平均值±标准误差。NV=未接种疫苗;IM=肌肉注射疫苗;鼻内接种

　　为了检查病毒体是否诱导细胞介导的免疫，在第二次接种后的第21天和第240天，从接种过疫苗的小鼠中获得T细胞悬液。使用未受病毒刺激的样品为每只小鼠设置门。综上所述，该门基于前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)特征来估计淋巴细胞群并排除碎片。对双态细胞进行前向散射高度(FSC-H)和前向散射面积(FSC-A)的双态绘图。7-AAD染色排除死细胞。采用cfsellow检测淋巴细胞的增殖情况，从而对各实验组(H1N1、H1N2和H3N2)的特异性增殖进行评价。用CD3e和CD45R/B220反染使我们分别进入T细胞和B细胞。在T淋巴细胞(CD3e+)中，CD4+ T细胞、CD8α+ T细胞、CD62L、CD44、CD25和CD69亚群用面板区分。在第一个分析中，在CD4+和CD8+人群中使用gate来分析T淋巴细胞亚群。在第二次分析中，门被用于CD69+和CD69+CD25+人群，在第三次分析中，门被用于CD3e+CD4+CD44highCD62Lhigh和CD3e+CD4+CD44highCD62Llow人群。在b淋巴细胞中，用小鼠b淋巴细胞活化抗体鸡尾酒和小鼠b淋巴细胞亚群抗体鸡尾酒染色活化淋巴母细胞。

　　体外刺激淋巴细胞增殖试验鉴定出十个不同的细胞亚群:CD3e+CD4+ (CD4+ T淋巴细胞)，CD3e+CD8α+ (CD8+ T淋巴细胞)，CD3e+CD69+CD25+(效应T细胞)，CD3e+CD4+CD44highCD62Lhigh(中枢记忆CD4+ T淋巴细胞)，CD3e+CD4+CD44highCD62Llow(效应记忆CD4+ T淋巴细胞)，CD19+CD69+CD25+(效应B细胞)，CD45R/B220+sIgM+(未成熟和成熟的B细胞或过渡性B细胞)，CD45R/B220+sIgM+CD23+(成熟静止的常规B细胞)。

　　值得注意的是，肌内和鼻内免疫诱导了强大的T细胞和B细胞应答(图5)。对于H1N1, H1N2和H3N2病毒，病毒体接种(肌内和鼻内免疫)小鼠的T细胞亚群水平比未接种或未接种的小鼠高2倍以上(图5)。肌内和鼻内免疫均导致更高的CD3e+CD4+， CD3e+CD8α+， CD3e+CD69+CD25+， CD3e+CD4+CD44highCD62Lhigh。和CD3e+CD4+ cd44highcd62low T细胞亚群(P≤0.0001)，H1N2 (P≤0.001)和H3N2 (P≤0.001)(图5和表S2，附加文件1)。给药途径影响某些细胞亚群的数量，鼻内免疫产生更多的CD3e+CD69+细胞(P≤0.05)，肌内给药产生更多的CD3e+CD69+CD25+细胞(P≤0.05;表5)。

　　图5

　　

　　体外细胞增殖试验。用疫苗病毒(H1N1、H1N2和H3N2)刺激脾细胞增殖试验，比较疫苗接种21天后鼻内(in)和肌内(IM)接种组的免疫细胞比未接种组(NV)的免疫细胞变化的倍数。数据显示，与未接种疫苗(NV)的小鼠相比，接种疫苗的小鼠的指示免疫细胞的平均百分比和标准误差增加了两倍。￥P≤0.05 vs NV，￡P≤0.005 vs NV， #P≤0.001 vs NV， φP≤0.0005 vs NV， *P≤0.0001 vs NV。

　　表5 H1N1, H1N2和h3n2特异性召回T和b细胞反应用病毒体肌注和鼻内免疫后的鼻窦炎

　　用病毒体免疫(肌内和鼻内)的小鼠在接种后21天(第36天)，与基线(P≤0.05)相比，H1N1, H1N2和H3N2的效效物(CD19+CD69+和CD19+CD69+CD25+)，过渡性和成熟B细胞(CD45R/B220+sIgM+)的绝对数量显著增加(图5;表5)相比之下，鼻内免疫比肌内免疫更有利于B细胞的建立，CD45R/B220+sIgM+， CD19+CD69+和CD19+CD69+CD25+细胞亚群，对于H1N1, H1N2和H3N2(表5)。

　　诱导持久的保护性免疫是疫苗接种的目标之一。因此，我们评估了病毒体疫苗接种诱导的H1N1、H1N2和H3N2抗体应答的寿命。病毒体免疫小鼠的H1N1、H1N2和h3n2特异性HI抗体反应维持在显著高于未接种小鼠的水平(图5)超过8个月，表明流感病毒免疫可以长期存在。

　　为了评估长期保护效果，在疫苗接种后8个月，用多价病毒体肌肉注射和鼻内注射小鼠组的细胞免疫反应也被分析。

　　如表5(给药途径的比较)和表S2，附加文件1(未接种疫苗组与肌肉注射疫苗组、未接种疫苗组与鼻内接种疫苗组的比较)所示，增强免疫8个月后，免疫小鼠与未接种疫苗组相比，CD45R/B220+sIgM+CD23+呈途径依赖性增加(P≤0.0001)。与未接种疫苗的小鼠相比，肌内和鼻内免疫小鼠对H1N1、H1N2和H3N2有显著的T细胞和b细胞增殖(P≤0.05;表S2，附加文件1)。然而，鼻内免疫小鼠显示出更高水平的t细胞亚群(CD3e+CD69+;表5)比肌内免疫小鼠增殖。肌内免疫对H1N1、H1N2和H3N2的CD3e+CD4+CD44high、CD62Lhigh和CD3e+CD4+CD44high、cd62low细胞亚群显著高于鼻内免疫(P≤0.05)，对H1N1的CD3e+CD69+CD25+和细胞亚群也显著高于鼻内免疫(表5)。肌内免疫在除呼吸粘膜以外的组织(如脾脏)中诱导了更大的记忆相关中枢反应。

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