生物膜的形成是慢性种植体相关骨感染的主要原因，因为生物膜保护细菌免受免疫系统和抗生素的侵害。此外，生物膜产生代谢微环境，使免疫反应转向耐受。在这里，我们比较了细菌环境的代谢物谱对巨噬细胞免疫激活的影响，使用金黄色葡萄球菌(SA)和表皮(SE)条件培养基(CM)的浮游和生物膜培养。生物膜环境降低了葡萄糖浓度，增加了乳酸浓度。此外，与相应的浮游CM相比，生物膜环境下巨噬细胞上典型免疫激活标志物的表达减少。然而，所有CM主要引起促炎性巨噬细胞细胞因子反应，并诱导tnf表达。在CM生物膜中，这伴随着更高水平的抗炎il - 10。另一方面，浮游CM诱导了IRF7介导的Ifnb基因表达，而这在生物膜环境中是不存在的。对于SA而不是SE浮游CM，这伴随着IRF3的激活。TLR-2/-9配体在不同代谢条件下刺激巨噬细胞发现，与生物膜环境一样，低葡萄糖浓度降低了Tnfa与Il10 mRNA的比值。然而，在TLR-2/-9刺激下，细胞外添加l -乳酸而不添加d -乳酸增加了Tnfa与Il10 mRNA的比值。总之，我们的数据表明，巨噬细胞激活背后的机制在浮游和生物膜环境中是不同的。这些差异与代谢物谱无关，表明不同细菌因子的产生最终比环境中葡萄糖和乳酸的浓度更重要。
慢性种植体相关骨感染是骨科和创伤手术的主要并发症，对患者造成严重后果，包括长期抗生素治疗、反复手术、种植体翻修，最严重时感染肢体截肢[1,2]。细菌可以利用留置的异物在种植体表面形成生物膜。这种感染通常是持续的，因为生物膜基质作为一个物理屏障，保护细菌不被宿主免疫系统和抗生素治疗根除[3,4,5,6]。此外，一些研究表明，生物膜的形成促进了更耐受的免疫反应，从而促进了细菌的存活[7,8]。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, SA)和表皮球菌(epidermidis, SE)是种植体相关骨感染中最常见的分离细菌[1,6]。SA表达多种毒力因子，能够形成小菌落变异(small colony variant, SCV)，能够在成骨细胞和破骨细胞内存活[9,10]，持续存在于骨皮质结构中[11]，并形成生物膜[12]。相比之下，共生SE主要依靠生物膜形成作为免疫逃避策略，但不产生侵袭性致病因子[13,14]。因此，SA主要发生在早期和急性感染中，这些感染与疼痛、肿胀和发烧有关，并且在抗生素和手术治疗后感染复发的风险很高[15]。SE仅引起轻度症状和低度炎症。因此，SE感染通常在感染转为慢性时才会被发现，这与生物膜的形成密切相关[16]。
先天免疫细胞对特定细菌病原体相关分子模式(PAMPs)的识别会激活模式识别受体(PRRs)，如toll样受体(TLRs)。PAMP与其各自的TLR结合可激活活化B细胞(NF-κB)通路的核因子“kappa-轻链增强子”，随后诱导炎症细胞因子。此外，TLR激活主要通过IRF7途径诱导1型IFN反应，导致IFN-α和IFN-β的产生[17]。除了tlr外，胞质PRRs包括nod样受体(nlr)和dsDNA传感器如cGAS/STING也有助于有效的免疫应答来抵抗入侵细菌[18,19]。SA脂肽与脂质胆酸(LTA)的结合通过表面结合的TLR-2触发免疫细胞活化，而细菌DNA基序的识别则通过内体TLR-9发生[20]。然而，讨论了生物膜的形成，通过掩盖或保留生物膜基质中的PAMPs来阻止嵌入细菌对TLR-2和TLR-9的识别[21,22]。
巨噬细胞是先天免疫细胞，在抵御病原体入侵的第一道防线中起着重要作用。它们与先天免疫系统的其他细胞一起，通过吞噬和产生抗微生物分子(如一氧化氮(NO)、抗微生物肽和细胞因子)来对抗细菌感染[23]。在体外，巨噬细胞可以分化为促炎型(M1)或抗炎型(M2)[24]，分别与细菌清除或耐受性和持久性有关[25]。这种分类是通过特定表面标记物的存在、诱导型一氧化氮合酶(iNOS, M1)或精氨酸酶1 (Arg-1, M2)的表达以及各自巨噬细胞群体的细胞因子谱(M1: TNF-α、IL-1和IL-12 vs. M2: IL-10和TGF-β)来定义的[25]。巨噬细胞亚型也以不同的代谢活动为特征。M1巨噬细胞主要依赖有氧糖酵解，M2巨噬细胞则与氧化磷酸化(OxPhos)相关[26]。通常，一种有效的促炎性巨噬细胞免疫反应能够清除浮游细菌引起的感染。然而，一旦这些细菌开始形成生物膜，这通常就会失败。在代谢方面，生物膜的形成以从环境中提取葡萄糖和由于生物膜内厌氧生长条件而积累乳酸等发酵产物为特征[27]。这种代谢微环境被认为支持生物膜介导的抗炎巨噬细胞极化，从而损害巨噬细胞发挥其清除功能[28]。
到目前为止，大多数研究都集中在研究生物膜形成后的感染。我们的目的是比较浮游和生物膜情况下巨噬细胞的免疫反应，并评估巨噬细胞极化的潜在差异。特别关注的问题是，不同的代谢物水平是否可能是浮游和生物膜环境中不同巨噬细胞激活的核心，或者这是由细菌因素的不同存在引发的。为了解决这个问题，我们分别用SA或SE浮游和生物膜培养产生的条件培养基(CM)处理小鼠RAW 264.7巨噬细胞，并分析了促炎或抗炎巨噬细胞反应的诱导和代谢活性。此外，我们评估了低葡萄糖或高乳酸浓度对TLR-2/-9联合刺激或SA浮游CM治疗巨噬细胞极化的影响。
使用金黄色葡萄球菌菌株ATCC 49230 (UAMS-1，分离自慢性骨髓炎患者)[29]和表皮葡萄球菌菌株DSM 28319 (RP62A，分离自导管脓毒症)制备条件培养基。细菌在含5%羊血(BD，德国)的哥伦比亚琼脂板上培养，实验前一天在新鲜琼脂板上划线。将3 ~ 5个菌落转移到胰酶大豆汤(TSB)中;BD，德国)，并在37℃下摇培养3小时，以获得生长状态的细菌。采用分光光度法(Den-1, Grant Instruments，英国)测定细菌密度，并在DMEM高葡萄糖(Anprotec，德国)+ 10%热灭活胎牛血清(FCS)中调整至6*105 CFU/ml;Biochrom GmbH，德国)浮游培养:在37°C和5% CO2条件下，摇瓶(200 rpm)培养24 h。生物膜培养:24孔，每孔1 ml，静培养6天。在生物膜培养中，每24小时仔细更换一次培养基。对于CM，培养24小时后的浮游培养基或第6天前最后24小时培养基更换，在4°C下4000 rpm离心15分钟，收获生物膜培养。对于生物膜CM，在离心前将孔的培养基池化。将收获的培养基铺在琼脂板上，在37°C下培养过夜，并控制细菌外观(菌落大小和颜色)以确保不受其他细菌的污染。上清液经0.2μm过滤器无菌过滤，冷冻于- 80°C。为排除剩余细菌生长，将无菌过滤培养基接种于TSB中，在37°C下培养过夜。在用于细胞培养前，用0.5 N NaOH滴滴定将CM的pH调整到生长培养基(DMEM高葡萄糖+ 10% FCS)的生理pH，并对pH指示剂酚红进行颜色检查。等分液保存在- 80°C。在同一实验中比较了同一方法的浮游和生物膜CM。对于未受刺激的CM对照，将各自方法的生长培养基(DMEM高葡萄糖+ 10% FCS)与不接种细菌的CM进行类似处理。
使用配备5毫米间接探测探头的400 MHz Bruker光谱仪(Bruker Ultrashield?Plus 400)获得了一种代表性CM方法的1H NMR光谱。每个频谱覆盖的频谱宽度为6.4 kHz。采用水信号抑制NOESY1D序列，30°脉冲，总重复时间6.5 s，确保样品中所有质子核完全松弛。在傅里叶变换之前，每个自由感应衰减(FID)乘以一个衰减常数为0.3 Hz的衰减指数。为了比较不同光谱，用富马酸钠(10 mM)作为内标，溶解在以D2O(99.9%)配制的0.2 M磷酸盐缓冲溶液中。核磁共振样品由140μl CM加35μl富马酸标准品组成。评价前，使用Bruker TopSpin 3.6.3软件对光谱进行相位调整和基线校正。通过将富马酸的共振设置为δ=6.5 ppm，进一步校准了光谱。为了比较不同的CM，通过平衡富马酸的共振来调整光谱。
实验采用小鼠巨噬细胞系RAW 264.7 (ATCC TIB-71, USA)[30]。RAW 264.7细胞在DMEM高糖+ 10%热灭活FCS + 1% Pen/Strep中培养，37℃，5% CO2。细胞包埋于合适的孔板中，用新鲜细胞生长培养基或PC 1:1稀释的CM处理(阳性对照:1μg/ml TLR-2配体Pam3CSK4和100 nM TLR-9配体CpG ODN 1668，均为美国invvivogen公司)。对于不同葡萄糖浓度的实验，实验前分别在高糖DMEM (4.5 g/l)和低糖DMEM (1 g/l, Anprotec，德国)培养基中培养1代细胞，然后在不同葡萄糖浓度的培养基中进行刺激。在不同细胞外乳酸浓度的实验中，L-或d -乳酸钠(10、15和20 mM，均为Sigma-Aldrich，德国)同时加入刺激。
为了进行FACS分析，200万个细胞/孔分别接种1ml新鲜生长培养基和1ml CM。20 h后，上清液在- 80°C冷冻以作进一步研究，并用冷PBS洗涤细胞两次。为了进行表面标记染色，将100μl细胞悬液留在PBS/2% BSA中作为未染色的对照，或用0.2 mg/ml FITC抗tlr -2 (Novus Biologicals，英国)、PE抗mhc II (Invitrogen，美国)、PE抗cd80或PE抗cd86(两种抗体都是biolgend，美国)抗体在4℃下染色1小时。细胞在冷PBS中洗涤2次，在150μl冷PBS中重悬，然后用BD FACSCanto?流式细胞仪(BD Biosciences，美国)进行分析。测量后，未染色的对照组用30 nM SYTOXTM Green核酸染色剂(Invitrogen, USA)孵育5分钟，记录活/死贡献。细胞内TLR-9染色，500μl细胞悬液与500μl固定缓冲液(biolgend, USA)混合，37℃孵育15 min, 2000 rpm离心5 min, PBS/5% BSA洗涤2次，4℃保存，PBS/5% BSA过夜。第二天，将细胞离心，用1ml - 20°C冷的TruePhos?Perm Buffer (biolgend, USA)重悬，在- 20°C下孵育1小时。细胞洗涤2次，用500μl PBS/2% BSA重悬。总共100μl的细胞悬液保持不染色，用0.5 mg/ml Alexa647抗tlr -9抗体(Novus Biologicals, UK)或各自的同种型在RT下染色30分钟。细胞洗涤两次，用300μl PBS/2% BSA重悬，用BD FACSCanto?流式细胞仪分析。使用Flowing Software(2.5.1版，Turku Bioscience, Finland)进一步分析结果。
FACS表面标记分析的上清液根据制造商的协议用于细胞头阵列(CBA, LEGENDplexTM, biolgend, USA)。小鼠炎症组(混合和匹配亚组)包括抗TNF-α， IL-10和IFN-β的珠粒。简而言之，将上清液离心并用Assay Buffer 1:5稀释;制备标准样品，将样品转移到v型底板中。制备好珠状混合物，加入样品中，在摇床上4°C黑暗中孵育过夜。次日，洗板2次，摇板，RT下加检测抗体孵育1次。加入链亲和素-藻红蛋白(SA-PE)，在RT下振荡孵育30 min。盘子洗两次;将球粒重悬于洗涤缓冲液中，用BD?LSR II流式细胞仪进行数据采集。使用随附的LEGENDplex?数据分析软件(version 8.0)分析和计算细胞因子浓度。
为了进行基因表达分析，细胞被刺激，如图图例所示。根据制造商的方案，使用innuPREP RNA Mini Kit 2.0 (Analytik Jena, Germany)进行总RNA提取。简而言之，细胞在裂解缓冲液中刮擦，并转移到DNA消除柱上。加入70%乙醇沉淀裂解物中的RNA，转移到RNA柱上，洗涤，在水中洗脱。使用NanoDrop?ND-1000分光光度计(Thermo Scientific, Germany)测量总RNA浓度。使用Biozym cDNA合成试剂盒(Biozym Scientific GmbH, Germany)根据制造商的协议，使用Oligo (dT)引物进行1微克总RNA的cDNA合成。将一个实验中所有样品的总RNA汇总，制备一个noRT样品(w/o逆转录酶)。cDNA在水中1:1稀释，保存于- 20°C。采用2微升cDNA模板和400 nM引物对(表1)进行qPCR。采用2 × qPCRBIO SyGreen Mix - rox (PCR Biosystems Ltd.， UK)，在60°C退火/延长温度40个循环的两步PCR反应(SteponePlus Real-Time PCR Cycler, Applied Biosystems, USA)中评估mRNA水平。qPCR运行的质量和qPCR产物的特异性通过每个实验纳入的noRT和水样以及引物对和熔化曲线的比较来控制。各感兴趣基因的mRNA水平(表1)归一化为参比基因Hprt1，并通过2CT法计算。
表1 Oligo列表用于定量RT-PCR分析的核苷酸
为了进行蛋白印迹分析，细胞被刺激，如图4所示。细胞在RIPA缓冲液(1% v/v NP-40 (IGEPAL?CA-630)， 0.25%脱氧巧克力酸钠，50 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8.0, 1 mM Na3VO4)中裂解，无EDTA蛋白酶抑制剂(cOmplete?片剂)和磷酸酶抑制剂(PhosSTOP?，均为罗氏诊断有限公司，德国)在4°C下旋转1小时。裂解液在4℃下14000 rpm离心20 min。用BCA法(意大利Cyanagen公司)测定蛋白质浓度，用ddH2O和5μl 4 × SDS样品缓冲液(含10% β-巯基乙醇)将样品调整为每20μl 10μg蛋白质，并上载于预制梯度4 - 20% tris -甘氨酸凝胶(命名为Elektrophorese GmbH，德国)。将蛋白转移到Amersham?pronan?0.45μm硝化纤维素膜(GE Healthcare, UK)上。用BlueBlock PF (Serva Electrophoresis GmbH, Germany)在室温下阻断膜30分钟，然后用一抗(表2)在4°C下孵育过夜。用TBST洗涤三次后，膜与抗兔酶联二抗(1:1000,Cell Signaling Technology，美国)在rt下孵育1小时。用ECL底物(WESTAR ETA C ULTRA 2.0, Cyanagen Srl，意大利)进行印迹，并在ChemoStar ECL和荧光成像仪(Intas Science Imaging Instruments GmbH，德国)上成像。
表2免疫印迹(Western Blot)所用抗体列表
以96孔形式共镀50,000个细胞/孔，用100μl CM和100μl新鲜生长培养基刺激24 h。将三个重复的上清混合保存在- 80°C以待进一步处理。根据制造商的方案(Lactate-Glo?assay, Promega GmbH, Germany)，使用基于酶的生物发光法测量CM以及CM刺激巨噬细胞上清液中的l -乳酸浓度。CM和上清液用1:50(浮游CM)或1:100(其他)用PBS稀释，包括定义l -乳酸浓度(0-200μM)的标准曲线。样品和标准品与乳酸检测试剂在室温下孵育1小时，用发光计(LUMIstar?Optima, BMG LABTECH，德国)记录发光。
以96孔形式共5万个细胞/孔，用100μl CM和100μl新鲜生长培养基刺激24小时。样品一组重复。除去培养基，加入100μl CTG试剂(CellTiter-Glo?，Promega GmbH, Germany;每孔加入1:1的PBS。细胞在连续震动下裂解1min。在黑暗中孵育10分钟后，将上清液转移到白色96孔板中。在亮度计(LUMIstar?Optima, BMG LABTECH，德国)中通过生物发光光反应测定相对ATP含量。
将30万个细胞/孔转移到24孔板中，用新鲜生长培养基1:1稀释的CM刺激，共1ml。24 h后，加入100 nM的线粒体膜电位敏感染料(stock conc)，测定线粒体活性。1 mM的DMSO, MitoTracker?Deep Red FM, Cell Signaling Technology, USA)在37°C和5% CO2条件下放置30分钟。然后用冷PBS洗涤细胞三次，在PBS中刮擦，并转移到FACS管中。根据染料的荧光强度，用BD FACSCanto?流式细胞仪分析线粒体活性。使用Flowing Software (version 2.5.1, Turku Bioscience, Finland)，只有活细胞群被纳入进一步分析。
实验按n=4或5个独立重复进行，如图图例所示。数据以平均值+标准差表示，单个值以点表示。统计评价采用单因素方差分析、事后多重比较检验和Bonferroni校正。p值小于0.05被认为具有统计学意义。星号表示对中值显著，数字符号表示不同处理间显著。使用GraphPad Prism for Windows (Version 9.3.1, GraphPad Software Inc.， USA)进行数据分析。
摘要
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材料与方法
结果
讨论
数据可用性
参考文献
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为了验证实验系统，我们监测了两种细菌菌株SA和SE形成生物膜的能力。如文献所述，我们可以复制SA菌株uaam -1在体外无涂层塑料表面上是中等生物膜生成物[31]，而SE菌株RP62A在体外塑料表面上具有很强的生物膜形成能力[32](图1A, B)。上清液是在浮游或生物膜特异性培养条件下从细菌培养中制备的(图1B，图1B)。C).这些上清液的1H-NMR分析显示，在浮游SA和SE的CM中仍然可以检测到葡萄糖，而所有葡萄糖都在各自的生物膜CM中代谢(图1D)。在所有条件下，细菌都释放出醋酸盐。有趣的是，SA和SE的含量不同，浮游SA和生物膜SE在CM中的含量更高。由于SA和SE生物膜培养的CM中乳酸含量明显增加，但在各自的浮游CM中只能检测到残留量，因此我们认为生成的CM代表了体内的情况，具有葡萄糖剥夺和乳酸积累的特征。
图1
选定菌株的生物膜形成和条件培养基的制备与表征。本研究选用金黄色葡萄球菌(SA)菌株ATCC 49230 (UAMS-1)和表皮葡萄球菌(SE)菌株DSM 28319 (RP62A)。实验前一天，细菌被新鲜地分离出来。为了产生对数相细菌，将3 - 5个菌落转移到TSB中，培养3 h，然后调整到106 CFU / ml。A研究菌株的体外生物膜形成。将含有1%葡萄糖的TSB中共100μl (105 CFU/孔)的细菌转移到96孔板中，在37℃下培养24、72和144 h。每24 h更换一次含有1%葡萄糖的TSB。通过结晶紫染色(1%结晶紫在水中)定量生物膜的形成。数据以570 nm处的OD表示，OD与生物膜质量成正比。n=2个实验，3个重复，显示平均值±标准差。B图片显示24小时后的浮游生物培养和6天后24孔静态培养的生物膜形成。条件培养基(CM)的生成，细菌(6*105 CFU/ well/ ml)在不含抗生素的生长培养基(DMEM高葡萄糖+ 10% FCS)中培养，温度37℃，CO2 5%。在生物膜形成过程中，每24小时更换一次培养基。C调整pH前各培养基的图片。浮游培养24 h或生物膜培养6 d后24 h离心无菌过滤收获CM。CM的D - 1H核磁共振光谱使用400 MHz布鲁克光谱仪(布鲁克Ultrashield?Plus 400)获得。为了比较不同光谱，用富马酸钠(10 mM)作为内标，溶解在以D2O(99.9%)配制的0.2 M磷酸盐缓冲溶液中。为了比较不同的CM，通过平衡富马酸的共振来调整光谱。然后比较不同CM之间代谢物的共振。所示为富马酸(单线态)生长介质和CM的多重显示展开图;δ=6.50 ppm)， 12C葡萄糖(双态;δ=5.22 ppm)， 12C醋酸酯(单线态;δ=1.90 ppm)和12C乳酸(双态;δ=1.31 ppm)。
为了评估SA和SE浮游或生物膜环境对巨噬细胞激活的潜在差异，我们分别用CM刺激RAW 264.7巨噬细胞。作为对照，我们也用TLR-2/-9配体Pam3CSK4和CpG ODN (PC)刺激细胞。图2A显示，浮游CM刺激巨噬细胞后，免疫激活标志物TLR-2、MHC II、CD80和CD86的表面蛋白表达比各自的生物膜CM增强得多。这与之前的研究结果一致，即生物膜环境促进了免疫细胞的耐受性。然而，细胞内TLR-9蛋白水平在浮游和生物膜CM之间仅略有增加，没有明显差异。我们进一步想评估巨噬细胞极化。因此，我们通过使用已建立的对照，验证了与促炎M1或抗炎M2表型相关的基因的诱导。图1)LPS/IFN-γ刺激以及我们的PC导致Nos2(编码iNOS的基因)、Tnfa和Ifnb mRNA水平升高，而Arg1基因表达仅在IL-4/IL-10处理下上调。这表明这些免疫介质的基因表达水平可以有效地决定巨噬细胞免疫反应的促炎性或抗炎性。由于TNF-α与促炎(M1)巨噬细胞表型相关，IL-10与抗炎(M2)巨噬细胞表型相关，因此各自mRNA水平的比值被用作巨噬细胞极化的指标。因此，在LPS/IFN-γ诱导的M1巨噬细胞中，Tnfa/Il10比值较高。图1 b)。出乎意料的是，CM刺激后巨噬细胞的基因表达分析显示，浮游和生物膜环境都能高度诱导Nos2。然而，Arg1的mRNA水平仅在生物膜CM中升高(图2B)。与此相一致的是，所有CM诱导促炎细胞因子Tnfa的表达程度相似，而抗炎细胞因子Il10的mRNA水平在生物膜CM中较高。Tnfa/Il10比值表明，与浮游CM相比，生物膜中的促炎巨噬细胞极化总体降低(图2C)。有趣的是，在浮游环境中，我们观察到Ifnb基因表达的诱导，这在生物膜CM中是检测不到的(图2D)。相应的蛋白分析证实，所有CM处理的TNF-α分泌均增加，其中SA浮游CM的浓度最低。此外，CM处理后，蛋白质水平上IL-10的释放增加，但与mRNA水平相比，浮游环境和生物膜环境之间没有差异。图2 a)。基因表达分析表明，浮游CM刺激后，IFN-β蛋白水平升高。图2 b)。然而，必须考虑到浮游SA CM中高蛋白A含量可能干扰了基于抗体的检测，并导致浮游SA CM处理的样品上清中测量的细胞因子浓度升高。
图2
条件介质刺激后巨噬细胞免疫激活。RAW 264.7细胞在新鲜培养基(DMEM高葡萄糖+ 10% FCS + 1% Pen/Strep) 1:1稀释的CM中培养，观察免疫应答。巨噬细胞的免疫标记谱。用CM刺激细胞20 h，用流式细胞仪检测细胞表面TLR-2、MHC复合体II (MHCII)、共刺激蛋白CD80和CD86以及内体TLR-9的蛋白水平。数据以荧光强度测量的中位表达水平表示。N=4或5次实验。相关免疫介质B-D基因表达分析。CM刺激细胞20 h, RT-qPCR检测M1标记物Nos2和M2标记物Arg1 (B)、促炎tnf和抗炎Il10 (C)、Ifnb (D) mRNA水平。Tnfa与Il10表达水平的比值被用作巨噬细胞极化的指标。数据显示为与内参基因Hprt1相关的感兴趣基因的相对基因表达。N=5个实验。E, F巨噬细胞中NF-κB、IRF3和IRF7信号的激活。用CM刺激细胞4小时，western blot观察磷酸化- nfκ b p65和磷酸化- irf3 (E)或磷酸化- irf7 (F)作为活化形式的转录因子的存在。以HSP90为加载对照，n=3个实验。对于A-D，数据以mean + SD表示，单个值以圆点表示。p值通过普通的单因素方差分析和事后bonferroni校正的多重比较计算。星号表示对Medium的显著性，数字符号表示各自浮游生物和生物膜CM之间的显著性。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001;#p < 0.05， ##p < 0.01， ###p < 0.001。PC，阳性对照(1μg/ml Pam3CSK4 + 100 nM CpG ODN)。
在信号转导水平上，我们发现NF-κB通路激活，磷酸化p65水平升高(图2E)，这与观察到的Tnfa和Il10表达升高一致。虽然SA和SE浮游CM能够触发Ifnb诱导的主要调控因子IRF7磷酸化，但IRF-3途径只有在SA浮游CM处理后才被激活。此外，由TLR激活引起的Ifnb基因表达与磷酸化- irf3无关，因为在PC中只观察到IRF7途径的激活(图2、E、F)。为了排除浮游和生物膜CM之间观察到的差异是由于细胞活力造成的，我们对死亡细胞进行了染色，但无法检测到处理组之间的任何差异(图2、E、F)。图2 c)。因此，我们的数据表明浮游生物和生物膜CM都会导致促炎巨噬细胞免疫反应;然而，生物膜CM处理后，免疫表面标记物的表达不那么突出，IFN-β反应的诱导仅限于浮游CM。
由于代谢状态决定免疫细胞的活性并支持免疫细胞极化，我们分析了CM处理后RAW 264.7巨噬细胞的代谢活性。在第一步，我们研究了CM中的l -乳酸水平。正如1H-NMR结果所预期的那样，浮游CM中只有低水平的l -乳酸，而生物膜CM中含有大量的细菌衍生的l -乳酸(图3A)。接下来，我们测量了CM刺激后RAW巨噬细胞培养物的l -乳酸水平。在这里，我们检测到在所有培养条件下的上清液中l -乳酸浓度增加。然而，必须考虑到细菌在生物膜形成过程中产生的l -乳酸有助于生物膜CM处理巨噬细胞上清中的l -乳酸浓度(图3B)。因此，我们将巨噬细胞上清中测量到的l -乳酸浓度校正为相应CM在新鲜细胞培养基中1:1稀释后的理论l -乳酸浓度。巨噬细胞计算的l -乳酸生成表明，细胞的有氧糖酵解增加，特别是在浮游环境中(图3C)。乌头酸脱羧酶1 (ACOD-1，也称为IRG-1)催化顺式乌头酸转化为抗炎衣康酸，从而中断克雷布斯循环，将细胞代谢活性转向糖酵解[33,34]。CM刺激后可诱导Acod1基因表达(图3D)。线粒体活性测定显示，CM刺激后也能诱导线粒体活性。这在SE生物膜的生物膜环境中最为明显(图3E)。在所有治疗条件下，总ATP水平保持相似(图3F)。
图3
条件介质刺激后巨噬细胞代谢的变化。RAW 264.7细胞在新鲜培养基(DMEM高葡萄糖+ 10% FCS + 1% Pen/Strep) 1:1稀释的CM中培养，观察代谢参数。条件培养基中l -乳酸的量。浮游培养24 h，生物膜培养6 d。最后一次培养基交换后24 h收获CM，用酶法测定l -乳酸浓度。数据以生物发光释放测量的浓度(mM)表示。N=5个实验。cm处理巨噬细胞上清液中l -乳酸的含量。用新鲜培养基中1:1稀释的CM刺激细胞24小时。上清中总l -乳酸通过酶法测定。数据以生物发光释放测量的浓度(mM)表示。N=5个实验。CM刺激后巨噬细胞释放C -l -乳酸。巨噬细胞释放l -乳酸的量由巨噬细胞上清总l -乳酸浓度减去新鲜生长培养基中1:1稀释CM的理论l -乳酸浓度计算。数据以浓度(mM)表示。N=5个实验。D . Acod1基因表达分析。CM刺激细胞4 h, RT-qPCR检测Acod1 mRNA表达水平。数据显示为与内参基因Hprt1相关的感兴趣基因的相对基因表达。N=5个实验。E巨噬细胞线粒体活性。用CM刺激细胞24小时，使用膜电位依赖性荧光染料通过FACS分析测定线粒体活性。数据以荧光强度测量的中位线粒体电位表示。N=4次实验。巨噬细胞产生F - ATP。用CM刺激细胞24 h，用酶基测定法(CTG)测定细胞裂解物中总ATP含量。数据以生物发光释放的相对光单位表示。N=4个实验(技术重复的平均值纳入统计)。所有数据均以平均值+标准差表示，单个值以点表示。p值通过普通的单因素方差分析和事后bonferroni校正的多重比较计算。星号表示对Medium的显著性，数字符号表示各自浮游生物和生物膜CM之间的显著性。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001;#p < 0.05， ##p < 0.01， ###p < 0.001。PC:阳性对照(1μg/ml Pam3CSK4 + 100 nM CpG ODN)。
总的来说，我们的数据证实，在促炎情况下，巨噬细胞代谢主要依赖于有氧糖酵解。同样，这在浮游生物环境中更为明显。特别是对于SE，在生物膜环境中，线粒体活性增加的转变变得明显，这通常与免疫反应的抗炎极化有关。
为了研究巨噬细胞活性模式的变化是否主要是由生物膜环境中代解物丰度的变化引起的，我们在高(4.5 g/l)和低(1 g/l)葡萄糖水平或在高糖培养基中添加不同浓度的乳酸的情况下，用TLR配体Pam3CSK4和CpG ODN (PC)刺激RAW 264.7巨噬细胞，并研究了巨噬细胞细胞因子反应和代谢活性。与以l -乳酸盐为主的真核生物相比，SA能够分别产生这两种对映体[35]。因此，我们在研究中纳入了d -乳酸盐。图4A显示，Tnfα或Il10的表达存在轻微的葡萄糖浓度依赖性变化，这导致低糖环境下的促炎巨噬细胞极化(Tnfα/Il10比值)较高糖环境有统计学意义的降低。葡萄糖转运体Slc2a1的基因表达水平不受培养基中葡萄糖含量的影响(图4B)。不同的葡萄糖浓度也没有改变基础或TLR诱导的线粒体活性(图4C)。在TLR-2/-9激活后观察到的Tnfa mRNA水平的增加通过添加细胞外l -乳酸进一步升高。然而，这并不伴随着Il10诱导的变化。总之，这导致细胞外l -乳酸在TLR-2/-9激活后，促炎巨噬细胞极化呈浓度依赖性增加(图4D)。有趣的是，细胞外l -乳酸水平的增加进一步增强了PC刺激后观察到的线粒体活性(图4E)。在培养基中添加d -乳酸对Tnfa基因表达水平没有影响，导致Il10 mRNA水平的诱导仅轻微但不显著(p=0.1989 PC vs. PC + 20 mM)，不足以改变巨噬细胞极化(图4F)。最终，细胞培养基FCS中存在的l -乳酸部分掩盖了d -乳酸的作用。这同样可以解释为什么d -乳酸浓度的增加会导致TLR-2/-9激活时线粒体活性的增加(图4G)。我们还研究了增加细胞外乙酸浓度的影响，发现Tnfa的基因表达水平仅轻微(p=0.1046 PC vs. PC + 20 mM)，但Il10的基因表达水平在高乙酸浓度下显着增加，这并没有导致促炎巨噬细胞极化的总体变化(补充)。图3)。
图4
生物膜代谢物谱对巨噬细胞TLR-2/-9反应的影响在低糖或高乳酸条件下，用PC(阳性对照:1μg/ml Pam3CSK4 + 100 nM CpG ODN)刺激RAW 264.7细胞20 h，观察细胞因子反应和线粒体活性。胞外葡萄糖浓度的影响。细胞在高(hg, 4.5 g/L)或低(lg, 1 g/L)葡萄糖培养基中受到PC刺激。A, B促炎tnf和抗炎Il10 (A)及葡萄糖转运蛋白Slc2a1 (B)基因表达分析。以tnf与Il10表达水平之比作为巨噬细胞极化的指标。数据显示为与内参基因Hprt1相关的感兴趣基因的相对基因表达。N=5个实验。C使用膜电位依赖性荧光染料，通过FACS分析测定线粒体活性。数据以归一化荧光强度表示，介质样本集为1。N=4次实验。D、E细胞外l -乳酸浓度的影响。细胞被PC刺激，在培养基中添加不同浓度的l -乳酸(10和20 mM)。D促炎tnf和抗炎il - 10基因表达分析。以Tnfa与Il10表达水平之比作为巨噬细胞极化的指标。数据显示为与内参基因Hprt1相关的感兴趣基因的相对基因表达。N=5个实验。E采用膜电位依赖性荧光染料，采用流式细胞仪(FACS)分析测定线粒体活性。数据以归一化荧光强度表示，介质样本集为1。N=4次实验。F, G细胞外d -乳酸浓度的影响。细胞被PC刺激，在培养基中添加不同浓度的d -乳酸(10和20 mM)。G促炎tnf和抗炎il - 10基因表达分析。以Tnfa与Il10表达水平之比作为巨噬细胞极化的指标。数据显示为与内参基因Hprt1相关的感兴趣基因的相对基因表达。N=5个实验。线粒体活性采用膜电位依赖性荧光染料进行FACS分析。数据以归一化荧光强度表示，介质样本集为1。N=4次实验。所有数据均以平均值+标准差表示，单个值以点表示。p值通过普通的单因素方差分析和事后Bonferroni校正的多重比较计算。星号表示对Medium的显著性，数字符号表示代谢物浓度之间的显著性。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001;#p < 0.05， ##p < 0.01， ###p < 0.001。
综上所述，我们的数据表明，环境中低葡萄糖或高乳酸浓度仅对TLR-2/-9介导的巨噬细胞中Tnfa和Il10基因表达的诱导有中等影响。虽然葡萄糖和乙酸(部分)可以促进抗炎，l -乳酸可以促进促炎的巨噬细胞免疫反应，但净效应仍然相对较小。
我们进一步研究了不同的葡萄糖和乳酸浓度是否影响巨噬细胞在SA浮游环境中产生IFN-β的能力。因此，我们研究了IRF3通路的激活以及随后Ifnb基因表达的诱导，看看在SA生物膜CM中观察到的低糖高乳酸环境是否能抑制该通路。我们用在高或低葡萄糖培养基中稀释的SA浮游CM或增加细胞外L-和d -乳酸浓度刺激细胞。采用SA生物膜CM刺激进行比较。图5A显示，葡萄糖不影响SA浮游环境下观察到的Tnfa和Il10 mRNA水平的升高，导致巨噬细胞极化状态不变。此外，不同细胞外葡萄糖浓度对Ifnb基因表达和IFN-β靶基因Isg15的诱导作用保持不变(图5B)。同样，SA浮游CM对NF-κB或IRF3通路的激活与细胞外葡萄糖浓度无关(图5C)。不同乳酸浓度的L-(图5 D- g)和D-(图5 H-K)结果可比较。我们可以观察到，浮游SA和SA生物膜CM在诱导Tnfa和Il10基因表达和促炎巨噬细胞极化方面的差异并不是由生物膜环境中乳酸浓度升高所引起的(图5 D, H)。此外，浮游SA CM刺激后Ifnb mRNA和p-IRF3蛋白水平不受细胞外L-或D-乳酸的影响(图5 E, F, I, p-IRF3)。与不添加乳酸的条件相比，在SA浮游CM刺激下，细胞对较高的细胞外L-或d -乳酸浓度有反应，Il6 mRNA水平略有增加(图5 G, K)。然而，这种增加没有达到SA生物膜样品中观察到的水平(图5 G, K)。
图5
生物膜代谢物谱对SA浮游CM诱导IRF3介导的Ifnb的影响。在SA植物中培养RAW 264.7细胞。在不同细胞外葡萄糖或乳酸浓度的新鲜生长培养基(DMEM高葡萄糖+ 10% FCS + 1% Pen/Strep)中1:1稀释，观察免疫应答。胞外葡萄糖浓度的影响。用植物SA刺激细胞。CM 1:1稀释高(hg, 4.5 g/L)或低(lg, 1 g/L)葡萄糖培养基。A, B刺激20 h后促炎tnf和抗炎il - 10 (A)和Ifnb (B)基因表达分析。Tnfa与Il10表达水平的比值被用作巨噬细胞极化的指标。数据显示为与内参基因Hprt1相关的感兴趣基因的相对基因表达。N=4或5次实验。C巨噬细胞中NF-κB和IRF3信号的激活。细胞刺激4小时，western blot观察磷酸化- nfκ b p65和磷酸化- irf3作为转录因子的活化形式的存在。以HSP90为加载对照，n=3个实验。D-G对细胞外l -乳酸浓度的影响。用植物SA刺激细胞。CM 1:1稀释培养基±15mm l -乳酸或SA生物膜CM进行比较。D、E刺激20 h后促炎tnf、抗炎il - 10 (D)、Ifnb (E)基因表达分析。Tnfa与Il10表达水平的比值被用作巨噬细胞极化的指标。数据显示为与内参基因Hprt1相关的感兴趣基因的相对基因表达。N=4次实验。F巨噬细胞中NF-κB和IRF3信号的激活。细胞刺激4小时，western blot观察磷酸化- nfκ b p65和磷酸化- irf3作为转录因子的活化形式的存在。以HSP90为加载对照，n=3个实验。G刺激20 h后il - 6基因表达分析。数据以SA植物的相对基因表达归一化形式呈现。厘米。N=4次实验。H-K细胞外d -乳酸浓度的影响。用植物SA刺激细胞。CM 1:1稀释±15mm d -乳酸培养基。G, H刺激20 H后促炎tnf、抗炎il - 10 (G)、Ifnb (H)基因表达分析。Tnfa与Il10表达水平的比值被用作巨噬细胞极化的指标。数据显示为与内参基因Hprt1相关的感兴趣基因的相对基因表达。N=4次实验。J巨噬细胞NF-κB和IRF3信号的激活。细胞刺激4小时，Western Blot观察磷酸化- nfκ b p65和磷酸化- irf3作为转录因子的活化形式的存在。以HSP90为加载对照，n=3个实验。刺激20 h后il - 6基因表达分析。数据以SA植物的相对基因表达归一化形式呈现。厘米。N=4次实验。对于A和B;D, E，和G;H、I、K，数据用mean + SD表示，单个值用圆点表示。p值通过普通的单因素方差分析和事后bonferroni校正的多重比较计算。星号表示对中值显著，数字符号表示不同处理间显著。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001;#p < 0.05， ##p < 0.01， ###p < 0.001。
我们的数据表明，在各自的生物膜环境中，人工低葡萄糖和高乳酸浓度结合SA浮游CM刺激巨噬细胞不足以诱导更抗炎的巨噬细胞免疫反应或阻止IRF3介导的Ifnb诱导。
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资讯来源：http://58ziyuan.cn/news/93792/
