使用两种不同的CRISPR酶开发一种更快更容易的COVID-19诊断测试

   日期:2025-07-25     来源:本站    作者:admin    浏览:63    
核心提示:      频繁、快速检测COVID-19对于控制疫情的传播至关重要,特别是在出现更具传染性的新变体的情况下。  虽然目前使用qR

  

  

  频繁、快速检测COVID-19对于控制疫情的传播至关重要,特别是在出现更具传染性的新变体的情况下。

  虽然目前使用qRT-PCR(定量逆转录聚合酶链反应(PCR))的金标准COVID-19诊断测试非常敏感,每微升检测到一个RNA拷贝,但它需要专门的设备、几个小时的运行时间和集中的实验室设施。因此,测试通常需要至少一到两天的时间。

  由加州大学伯克利分校Jennifer Doudna、David Savage和Patrick Hsu实验室的科学家领导的一个研究小组,正致力于开发一种比qRT-PCR更快、更容易部署的诊断测试。现在,该公司将两种不同类型的CRISPR酶结合在一起,创建了一种可以在不到一小时内检测到少量病毒RNA的检测方法。杜德纳因发明CRISPR-Cas9基因组编辑技术而获得2020年诺贝尔化学奖。

  虽然这项新技术还没有达到与qRT-PCR的灵敏度相媲美的阶段,qRT-PCR每微升液体只能检测到几个病毒拷贝,但它已经能够检测到病毒RNA的水平——每微升大约30个拷贝——足以用于监测种群并限制感染的传播。

  研究人员将在8月5日的《自然化学生物学》杂志上在线报告他们的研究结果。

  美国食品和药物管理局已经批准了几种基于crispr的检测方法用于紧急使用,但所有这些方法都需要一个初始步骤,即病毒RNA被放大,以便检测信号——包括释放一种在蓝光下发光的荧光分子——足够亮,可以被看到。虽然这种初始扩增将测试的灵敏度提高到与qRT-PCR相似的水平,但它也引入了一些步骤,使测试更难以在实验室外进行。

  加州大学伯克利分校领导的研究小组试图在不牺牲实验简单性的情况下达到有用的灵敏度和速度。

  “对于护理点应用,你希望有一个快速的反应,这样人们就可以快速知道他们是否被感染,例如,在你上飞机或去探亲之前,”团队负责人蒂娜·刘说,她是创新基因组学研究所(IGI)杜德纳实验室的研究科学家,该研究所是一个专注于crispr的中心,涉及加州大学伯克利分校和加州大学旧金山分校的科学家。

  除了多了一个步骤之外,初始扩增的另一个缺点是,由于它会复制数十亿份病毒RNA,因此在患者样本之间产生交叉污染的可能性更大。该团队开发的新技术将这种情况颠倒过来,取而代之的是增强荧光信号,消除了交叉污染的主要来源。

  这种无扩增技术被他们称为快速集成核酸酶串联检测(FIND-IT),它可以为许多其他传染病提供快速和廉价的诊断测试。

  刘说:“虽然我们开始这个项目的明确目的是影响COVID-19,但我认为这种特殊的技术可能不仅仅适用于这次大流行,因为最终,CRISPR是可编程的。”“所以,你可以在CRISPR酶上装载一个针对流感病毒、HIV病毒或任何类型的RNA病毒的序列,这个系统有可能以同样的方式工作。这篇论文确实确立了这种生物化学是一种更简单的检测RNA的方法,并且能够在敏感和快速的时间框架内检测到RNA,这可能适用于未来的护理诊断应用。”

  研究人员目前正在使用FIND-IT建立这样一种诊断方法,其中包括收集和处理样品,并在紧凑的微流体装置上运行检测。

  为了从方程式中去除目标扩增,研究小组首先使用CRISPR酶Cas13来检测病毒RNA,然后使用另一种称为Csm6的Cas蛋白来放大荧光信号。

  Cas13是一种切割RNA的通用剪刀;一旦它结合到由向导RNA指定的目标序列上,它就开始切割大范围的其他RNA分子。这种靶触发的切割活性可以利用对特定RNA序列的偶联检测来释放荧光报告分子。然而,就Cas13本身而言,当存在非常少量的靶RNA时,它可能需要数小时才能产生可检测的信号。

  刘的见解是使用Csm6来放大Cas13的作用。Csm6是一种CRISPR酶,它能感知到RNA小环的存在,并被激活以切割细胞中广泛的RNA分子。

  为了提高Cas13的检测,她和她的同事们设计了一种特殊的工程激活分子,当Cas13检测到病毒RNA时,它会被切割。该分子的一个片段可以与Csm6结合并触发Csm6从RNA片段上切割并释放出明亮的荧光分子。通常,激活剂分子会被Csm6迅速分解,从而限制了其产生的荧光信号的数量。刘和她的同事们设计了一种化学修饰激活剂的方法,使其免受降解,并能使Csm6过载,反复切割和释放与RNA相连的荧光分子。这导致灵敏度比原来的激活剂好100倍。

  “当Cas13被激活时,它会分裂这个小的激活子,去除保护它的片段,”Liu说。“现在它被释放了,它可以激活第二种酶Csm6的许多不同分子。因此,Cas13识别的一个靶标不仅会激活其自身的rna切割能力;它导致产生更多的活性酶,每个酶都可以裂解更多的荧光报告蛋白。”

  研究小组还结合了一种优化的引导RNA组合,使Cas13能够更敏感地识别病毒RNA。当它与Csm6及其激活剂结合使用时,研究小组能够在短短20分钟内检测到每微升低至31个拷贝的SARS-CoV-2 RNA。

  研究人员还将从患者样本中提取的RNA添加到FIND-IT实验中,并将其放入微流体盒中,以观察该实验是否可以在便携式设备上运行。使用一个带摄像头的小型设备,他们可以检测从患者样本中提取的SARS-CoV-2 RNA,其灵敏度可以捕捉到COVID-19感染的高峰期。

  刘说:“这种串联核酸酶方法——Cas13加Csm6——在37摄氏度的单一温度下将所有东西结合成一个单一的反应,所以它不需要高温加热或多个步骤,而其他诊断技术是必要的。”“我认为这为更快,更简单的测试提供了机会,可以达到与其他现有技术相当的灵敏度,并且可能在未来达到更高的灵敏度。”

  这种无扩增RNA检测方法的开发源于IGI在COVID-19诊断和治疗问题开始大流行时重新定位研究方向。最终,加州大学伯克利分校的五个实验室和加州大学旧金山分校的两个实验室参与了这个研究项目,这是IGI众多实验室中的一个。

  “当我们开始这项研究时,我们希望创造出与PCR相当的东西,但不需要扩增-这将是我们的梦想,”萨维奇说,他是该项目的首席研究员。“从敏感性的角度来看,我们有大约一万倍的差距要跨越。我们把它放大了一千倍;我们已经把它降低了三个数量级。好了,我们快完成了。去年4月,当我们真正开始制定计划时,这似乎几乎是不可能的。”

 
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